Джо ДеРизи и его «Вироскан» раскрывают тайны медицины

Как мы можем исследовать окружающую нас вирусную флору и помочь медицине? Как мы можем превратить накопленные нами знания по вирусологии в один простой портативный диагностический прибор? Я хочу превратить всё, что мы знаем на данный момент о диагностике вирусов и диапазоне вирусов, окружающих нас, в, с позволения сказать, маленький чип.

Когда мы начали думать об этом проекте — о том, как сделать единый диагностический прибор, чтобы выявить все болезнетворные факторы одновременно — с воплощением этой идеи в жизнь возникли некоторые проблемы. Прежде всего, вирусы весьма сложны, и к тому же они эволюционируют очень быстро. Это пикорнавирус. Пикорнавирусы включают вирусы банальной простуды, полиомиелита и других подобных заболеваний. Вы видите внешнюю оболочку вируса, и жёлтым цветом здесь выделены те его части, которые развиваются очень быстро, а синим — те, которые развиваются медленней. Когда люди задумываются о создании выявляющих поливирусы реагентов, главным препятствием становится стремительное развитие вирусов, ибо как можно обнаружить то, что постоянно меняется? Но развитие основано на равновесии: когда что-то одно быстро меняется, что-то другое сохраняется неизменным, почти никогда не меняясь.

Таким образом, мы решили исследовать этот вопрос более подробно, и сейчас я покажу вам результаты. Эту работу можно проделать на обычном компьютере. Я взял несколько пикорнавирусов, таких как возбудители простуды, полиомиелита и другие, и разделил их на крошечные сегменты. В качестве первого экземпляра был взят вирус Коксаки, который был разбит на маленькие ячейки. И я закрашиваю эти маленькие ячейки синим цветом, если в геноме другого вируса есть последовательности, идентичные вирусу Коксаки. Их можно увидеть здесь — и к слову, они даже не несут информацию о белке — они почти полностью одинаковы во всём этом ряде вирусов, поэтому я смог использовать эту последовательность как маркер для выявления широкого спектра вирусов, не работая с каждым из них отдельно. Здесь видно большое разнообразие: эти части вирусов быстро развиваются. А здесь заметно менее стремительное развитие: разнообразия уже меньше.

А теперь, если, предположим, взять вирус острого паралича пчёл — вероятно, весьма опасный, если вы пчела — у этого вируса почти нет сходства с вирусом Коксаки, но я ручаюсь, что наиболее стабильные цепочки генов у этих вирусов с правой стороны экрана находятся в тех же областях, что и у остальных. Таким образом, мы можем выделить участки с максимальной стабильностью в ходе эволюции вируса - выбрав всего лишь фрагменты ДНК или РНК в данных участках в качестве выявляющих реагентов для нашего чипа.

Итак, это наша задача, но как её выполнить? Долгие годы, с того момента, как я начал изучать эту проблему в университете, я бился над созданием ДНК-чипов - как например,отпечатывание ДНК на стекле. И вот что вы здесь видите: Эти крошечные солевые пятна - всего лишь прикрепленная к стеклу ДНК, и я могу поместить тысячи таких ДНК на такой стеклянный чип и использовать их в качестве выявляющих реагентов. Мы передали свой чип компании Hewlett-Packard и использовали их мощный атомарный микроскоп для исследования одного из таких пятен, И вот что там видно: на этом стекле вы можете увидеть нити ДНК. И мы всего лишь отпечатываем ДНК на стекле - на маленьких стеклышках - и эти отпечатки становятся маркерами для патогенов. Для создания этих чипов в лаборатории я использую крошечных роботов, я увлекся внедрением этой технологии в повседневную жизнь. Если ваших средств достаточно на покупку Камри, вы тоже можете построить одного из таких роботов, и для этого мы разместили в Интернете абсолютно бесплатное руководство к действию с основной последовательностью действий по сборке. Вы можете построить прибор для отпечатки набора фрагментов ДНК в своём собственном гараже. А этот раздел посвящен остановке в случае аварийной ситуации. (Смех) У каждого значительного механизма должна быть большая красная кнопка. Но честно говоря, он редко выходит из строя. Вы в самом деле можете создавать ДНК-чипы у себя в гараже и достаточно быстро расшифровывать генетические программы. Это весело. (Смех)

Итак, что же мы сделали - и это весьма интересный проект- мы начали создавать ДНК-чип респираторного вируса. Я рассказывал об этом - вам известна ситуация, когда вы приходите в клинику, а причину вашего заболевания не могут выявить? Мы поместили ДНК основных респираторных вирусов человека на один чип, добавив туда же для ровного счета вирус герпеса - а почему бы нет? В первую очередь ученый должен убедиться, что материал работает. И вот что мы сделали: взяли культивируемую клеточную среду и инфицировали клетки разными вирусами, затем взяли этот материал и флюоресцентно маркировали полинуклеотид, генетический материал, выделенный из этих культивируемых клеток, вирусный материал - и поместили его на чип, чтобы определить, к какому участку он приклеится. Итак, если последовательности ДНК соответствуют друг другу, они склеиваются, и тогда мы можем обратить внимание на пятна. Если они светятся, мы понимаем, что в данном месте точно находится вирус.

Вот как выглядит один из таких чипов, и эти красные пятна представляют собой поступающие от вирусов сигналы. Каждое пятно соответствует определенному семейству вирусов или виду вируса. Это изображение достаточно трудно для восприятия, поэтому я хочу представить данные в виде определенного штрих-кода, сформированного по семействам для более наглядного отображения результатов. Мы взяли культивируемую клеточную среду и инфицировали клетки аденовирусом, и вы можете рассмотреть этот желтый штрих-код около аденовируса. И подобным образом мы инфицировали эти клетки вирусом парагриппа 3-ого типа - это парамиксовирус - и вы можете увидеть здесь этот штрих-код. Затем последовал респираторный синтициальный вирус. Это повсеместный бич всех детских садов - сопли, проще говоря. (Смех) Как вы видите, этот штрих-код обозначает одно и то же семейство, но он отличен от вируса парагриппа 3-ого типа, вызывающего тяжелейшую простуду. Так у нас появляются уникальные показатели, отпечатки пальцев для каждого вируса. Полио и риновирусы принадлежат одному семейству и очень похожи друг на друга. Риновирусы вызывают банальную простуду, а что такое полиовирус вам прекрасно известно, и вы видите, что показатели этих вирусов различны. А ассоциированный с саркомой Капоши вирус герпеса демонстрирует здесь весьма яркие показатели. И это не любая полоска или что-либо, сообщающая мне о наличии в образце вируса определенной разновидности; это штрих-код, который дает представление о ситуации в целом.

Отлично, я вижу один риновирус - а это увеличенный снимок риновирусного штрих-кода - но как быть с другими риновирусами? Откуда я узнаю, какой именно это риновирус? Существует 102 известных варианта вирусов простуды, и их всего лишь 102 просто потому, что люди устали их считать: новые разновидности появляются ежегодно. Существует четыре разных риновируса, и можно увидеть даже невооруженным взглядом, без затейливых компьютерных сопоставлений образцов алгоритмов програмного обеспечения для распознавания, для того, чтобы отличить один штрих-код от любого другого.

Итак это что-то вроде удара по больному месту, так как мне известно, какова генетическая последовательность всех этих риновирусов, и я даже спроектировал чип чтобы отличать их друг от друга, но как быть с риновирусами, которые никогда не видел ни один генетик? Нам неизвестна их генетическая последовательность, и мы просто закрываем на них глаза. Итак, вот четыре риновируса, о которых нам на было ничего известно - никто никогда не исследовал их генетически - и как видите, эти образцы уникальны и различимы. Представьте, что вы построили реальную или виртуальную библиотеку "отпечатков пальцев" всех значимых вирусов. Вы ведь знаете, что это проще простого, так? У вас есть культивируемая клеточная среда. И тонна вирусов. А что насчет живых людей? Как вам и самим, наверное, известно, вы не можете их контролировать. Вы даже представить себе не можете, что именно попадет в чашку человека при кашле, а ведь состав может быть очень сложным , не правда ли? В слюне может быть множество бактерий и вирусов, и безусловно, генетический материал хозяина. Так как же со всем этим разобраться? И как в данном случае осуществлять положительный контроль?

Что ж, довольно просто. На этой фотографии я делаю назальный смыв. Идея заключается в вакцинировании людей в условиях эксперимента. Кстати, с одобрения международного экспертного совета; и участие в эксперименте оплачивается. Мы прививали людей экспериментальной вакциной против ОРВИ. Или, даже лучше, давайте возьмем людей непосредственно в приемном покое - с неопределенным диагнозом, бытовой инфекцией дыхательных путей. Вы не представляете, кто может зайти в дверь. Что ж, давайте займемся сперва положительным контролем, зная, что человек здоров. Вирусы попадают в его организм через нос, и что же происходит?

День первый: ничего не происходит. Человек здоров; он не заражен - это невероятно. Фактически, мы считали, что носовые ходы могут быть забиты вирусами, даже когда вы прогуливаетесь в полном здравии. Это относительная незараженность. Если вы здоровы, вы относительно здоровы. День второй: мы получаем полноценный образец риновируса, который весьма схож с тем, что мы получаем в лаборатории во время экспериментов с клеточными культурами. Здорово, но это опять удар по больному месту, не так ли? Мы поселили тонну вирусов в нос этого мужчины. Итак - (Смех) Я имею в виду, мы хотели, чтобы это сработало. Он и правда подхватил простуду. А как насчет людей, прогуливающихся по улице?

Вот безликие идентификационные коды двух человек. Они оба заражены риновирусами; мы никогда не видели такие образцы в лаборатории. Мы исследовали генетические последовательности части этих вирусов; они абсолютно новые и ранее никем не замеченные. Помните, те застывшие в развитии последовательности генов, которые мы используем на чипе, позволяют нам выявлять даже ранее неизвестные или неохарактеризованные вирусы, так как мы отбираем то, что сохранилось в ходе эволюции. Это другой человек. И здесь вы можете сами поиграть в диагностов. Отдельные участки представляют здесь разные вирусы семейства паравирусов, и вы можете исследовать эти участки и увидеть, где заметен импульс. Ну, собачьего бешенства нет, и это уже неплохо. (Смех) Но достигнув девятого участка, вы увидите этот синцитиальный респираторный вирус. Может быть, у этого человека есть дети. И вы можете также наблюдать члена его семьи: данный вирус обозначен и здесь. Что ж, замечательно. А это другой человек, наблюдаемый в течение двух дней - при повторных посещениях клиники. У него парагрипп 1 типа, и прямо здесь мы можем видеть крошечную маркировочную линию вируса Сендай: это мышиный парагрипп. Генетическая связь между ними очень тесна. И это очень весело.

Итак, мы создали чип. Мы создали чип, на котором есть генетическая информация о любом известном нам вирусе. А почему бы нет? Любой растительный вирус, любой вирус насекомых, любой морской вирус. Всё, что мы можем достать из генетического банка - так называемый, всенародный склад генетических последовательностей. И теперь мы используем такой чип. Но зачем мы это делаем? Что ж, прежде всего когда у вас есть такой большой чип, вам нужна большая информативная поодержка, поэтому мы спроектировали систему, способную к автоматической диагностике. И план заключается в наличии у нас виртуальных образцов, так как мы никогда не заполучим образцы всех вирусов - это было бы просто невозможно. Но мы можем использовать виртуальные образцы, и сравнивать их с результатами экспериментов - весьма запутанными - и вести что-то вроде счета, какова вероятность, что это именно риновирус. И вот на что это похоже. Если, например, вы использовали клеточную культуру, постоянно инфицируемую папилломовирусом, вы получаете компьютерную выборку показателей, и согласно нашему алгоритму это папилломовирус 18 типа. И именно им на самом деле клеточная культура постоянно инфицируется.

А теперь кое-что потруднее. В клинике мы установили звуковой сигнализатор. Каждый раз, когда в клинику попадал человек с неизвестным диагнозом, они звонили нам. Вот это идея, и мы воплотили её в жизнь в Сан-Франциско. И эта история болезни имела место быть три недели назад. У нас есть 28-летняя здоровая женщина, никогда не выезжавшая за пределы родных мест, (неразборчиво), некурящая, не пьющая алкогольные напитки, с десятидневной лихорадкой, ночными потоотделениями, кровянистой мокротой она кашляет кровью - и мышечной болью. Когда она попала в клинику,ей назначили антибиотики и отправили домой. Она вернулась после десяти дней лихорадки, так? По-прежнему, с лихорадкой, и с гипоксией - за счет недостатка кислорода в легких. Ей провели компьютерную томографию. Все, что здесь темное и черное, - это нормальная легочная ткань. А вот всё, что белого цвета, - в этом уже нет ничего хорошего. Такая легочная структура в виде разветвленной структуры с завязями показывает, что ткань воспалена; и воспаление, скорее всего, инфекционное. Пациентку лечили цефалоспоринами третьего поколения и доксициклином, и на третий день это не помогло: болезнь спрогрессировала в острую легочную недостаточность. Им пришлось заинтубировать пациентку, поместив интубационную трубку в её горло и подключить её к аппарату искусственной вентиляции легких. Она не могла больше дышать самостоятельно. А что делать дальше? Неизвестно. Поменять антибиотики: они перешли на другой антибиотик, Тамифлю. Непонятно, почему они решили, что у пациентки грипп, но перешли на Темифлю.

И на шестой день, они, наконец, сдались. За неимением другого выбора, была проведена открытая биопсия легких. А уровень смертности при такой операции составляет восемь процентов, и что же - что они узнали таким способом? Вы смотрите на открытую биопсию легких этой пациентки. Я не патологоанатом, но что можно сказать, глядя на это? Единственное - здесь есть признаки значительного отека - бронхиолита. Болезнь недиагносцируема: это заключение патологоанатома. Так для чего же они её обследовали? Безусловно, они делали анализы, и проводили анализы по более, чем семидесяти показателям, анализы на все виды бактерий, грибов и вирусов, существующих в природе: ОРВИ, метапневмовирус, ВИЧ, РСВ - на все. Все анализы стоимостью более 100000 долларов за анализ были отрицательны. Я имею в виду, что они сделали для этой женщины всё, что могли.

И наконец, на восьмой день позвонили нам. Они дали нам эндотрахиальный аспират - знаете, жидкость из горла, из трубки, поставленной ими - отдали её нам. Мы поместили его на чип, и что же мы увидели? Увидели мы вирус парагриппа 4-ого типа. И что же, ради всего святого, это за вирус? Не существует анализов на парагрипп 4-ого типа. Никто не воспринимает его всерьез. Его генетические последовательности выделены не полностью. Выделена лишь малая их часть. Эпидемиологических научных трудов об этом вирусе не существует. Никто даже не мог предположить именно этот вирус, так как ни у кого не было подозрений, что он может вызывать дыхательную недостаточность. Отчего так? Обычная практика.У нас нет данных - нет данных, что этот вирус может вызывать заболевания разной степени сложности. Очевидно, разговор идет о единичном случае заболевания.

Ладно, это всего лишь одна история болезни. Но в последние две минуты я хочу вам рассказать ещё кое-что неопубликованное - о чем станет известно только завтра - и это интересная информация о том, как вы можете использовать этот чип для открытия новых горизонтов. Рак предстательной железы. Нет нужды приводить здесь статистические данные о раке предстательной железы. Почти каждый их знает: третье место среди причин смерти раковых больных в США. Множество факторов риска, но существует генетическая предрасположенность к этому виду рака. Где-то 10% больных раком предстательной железы - это люди, имеющие к нему предрасположенность. И первым геном, выявленным в совместных исследованиях рака предстательной железы на ранней стадии, стал ген, названный рибонуклеаза L. Что это такое? Это защитный антивирусный фермент. Итак мы сидим и думаем: "Почему мужчины с генной мутацией - повреждением антивирусной защитной системы - заболевают раком предстательной железы? Это бессмысленно - разве что, может, там есть вирус?"

И так мы помещаем опухоли - а сейчас у нас их более ста - на свой чип. И мы знаем, у кого есть дефект рибонуклеазы L, а у кого нет. И я покажу вам импульс на чипе, покажу вам комплекс ретровирусных олигопептидов. И по вирусу можно заключить, что мужчины с генной мутацией в этом антивирусном защитном ферменте и с опухолью, в 40 процентах обладают признаками, свидетельствующими о новом ретровирусе. Звучит дико. Что же это? Итак, мы клонируем целый вирус. Прежде всего, автоматизированное прогнозирование показало нам, что он очень похож на мышиный вирус. Но это ни о чем нам не говорит, и поэтому мы клонировали вирус целиком. И вирусный геном я покажу вам прямо сейчас. Это классический гамма ретровирус, но он абсолютно новый; никто раньше его не видел. Он, действительно, очень близок к мышиному вирусу, и поэтому мы могли бы назвать этот вирус ксенотропным, так как он инфицирует виды организмов, не только мышей. А это маленькое филогенетическое дерево показывает его соотношение с другими вирусами. Мы уже сделали это для многих пациентов, и можно сказать, все они инфицированы независимо друг от друга. У них у всех вирус один и тот же, но различный настолько, становится очевидным, что они попали в организм пациентов независимо друг от друга. И все это есть в ткани? Я окончательно отвечу: да. Мы взяли срезы биопсийных тканей опухоли и использовали этот материал для локализации вируса, обнаружив в нем клетки с вирусными частицами. У этих людей на самом деле есть данный вирус.

Вызывает ли он рак предстательной железы? Ничто из мною сказанного не отвечает на этот вопрос. Я не знаю. Есть ли связь у вируса с онкогенезом? Не знаю. Может, дело в том, что эти люди более восприимчивы к вирусам? Может быть. А может, связи между вирусом и раком нет вовсе. Но ведь это зацепка. Нами доказана сильная связь между присутствием вируса и генетической мутацией, ведущей к раку. Вот к чему мы пришли. И я боюсь, наши исследования принесли больше вопросов, чем ответов, но наука на то и наука, чтобы спрашивать. Все эти открытия были сделаны в лаборатории - Я не могу вменять большинство из них себе в заслугу. Это результат моего сотрудничества с Доном. Этот человек запустил данный проект в моей лаборатории, а этот занимался исследованиями предстательной железы. Спасибо большое. (Апплодисменты)