O ViroScan de Joe DeRisi soluciona mistérios médicos

Como é que, como nós podemos investigar esta flora de vírus que nos rodeia, e ajudar a medicina? Como nós podemos transformar nosso conhecimento cumulativo em virologia em uma ferramenta de diagnóstico simples e portátil? Eu quero transformar tudo que nós sabemos agora sobre a detecção de vírus e sobre o espectro de vírus que está por aí em, digamos, um pequeno chip.

Quando nós começamos a pensar sobre esse projeto -- como nós poderíamos fazer um único teste de diagnóstico para procurar por todos os patógenos simultâneamente -- bem, existem alguns problemas com essa idéia. Primeiro, os vírus são bem complexos, mas eles também estão evoluíndo muito rapidamente. Isso é um picornavirus. Os Picornavirus -- essas são coisas que incluem a gripe comum e a polio, coisas como essas. Você está olhando para a casca exterior do vírus, e a cor amarela aqui são aquelas partes do vírus que estão evoluíndo muito, muito rapidamente, e as partes azuis não estão evoluíndo muito rapidamente. Quando as pessoas pensam em fazer reagentes de detecção pan-viral, geralmente o problema maior é a evolução rápida, porque como nós podemos detectar coisas se elas estão sempre se modificando? Mas a evolução é um equilíbrio: onde você tem a mudança rápida, você também tem a ultra-conservação -- coisas que quase nunca mudam.

E então nós olhamos para isso com um pouquinho mais de cuidado, e eu vou mostrar dados para vocês agora. Isto é apenas uma das coisas que você pode fazer no computador, da sua mesa. Eu peguei alguns desses pequenos picornavirus, como a gripe comum, a pólio e assim por diante, e eu apenas os quebrei em pequenos segmentos, e então pegue esse primeiro exemplo, que é chamado Coxsackievirus, e apenas quebre-o em pequenas aberturas. E eu estou colorindo essas pequenas aberturas de azul se outro vírus compartilha de uma sequência idêntica à desse vírus no seu genoma. Essas sequências aqui --- que não codificam para proteínas, por exemplo -- são praticamente absolutamente idênticas considerando todas elas, assim eu poderia usar essa sequência como um marcador para detectar um amplo espectro de vírus, sem ter que fazer alguma coisa individual. Agora, aqui existe grande diversidade: é aí que as coisas estão evoluindo rapidamente. Aqui você pode ver uma evolução mais lenta: menor diversidade.

Agora, quando nós chegarmos aqui, vamos dizer, o vírus da paralisia aguda de abelhas -- provavelmente um vírus ruim se você for uma abelha -- esse vírus não compartilha quase nenhuma semelhança com o Coxackievirus, mas eu posso garantir a vocês que as sequências que são mais preservadas nestes vírus no lado direito da tela estão em regiões idênticas aqui em cima. E então nós podemos encapsular essas regiões de ultra conservação através da evolução -- como esses vírus evoluiram -- apenas escolhendo elementos de DNA ou de RNA nessas regiões para representar em nosso chip como reagentes para detecção.

OK, isso é o que nós fizemos, mas como nós vamos fazer isso? Bom, por um longo tempo, desde que eu fazia mestrado, eu brincava de construir chips de DNA -- isto é, imprimindo DNA em vidro. E isso é o que você vê aqui: Essas pequenas manchas de sal são apenas DNA impresso em vidro, e então eu posso colocar milhares desses em nosso chip de vidro e usá-los como um reagente de detecção. Nós levamos nossos chips para a Hewlett-Packard e usamos a força atômica e microscópica deles em uma dessas manchas, e isso é o que você vê: você pode na verdade ver as bandas de DNA espalhadas no vidro aqui. Então, o que nós estamos fazendo é apenas imprimindo DNA em vidro -- pequenas coisas achatadas -- e esses serão marcadores para patógenos. OK, eu faço pequenos robôs no laboratório para fazer esses chips, e eu sou um grande fã de disseminar tecnologias. Se você tem dinheiro suficiente para comprar apenas um Camry, você pode construir um desses, também, e então nós colocamos um guia de como fazer na Web, completamente grátis, com basicamente peças de pronta entrega -- você pode construir uma máquina que agrupa DNA na sua garagem. Aqui está a seção do todo poderoso interruptor de parada de emergência. (Risos) Toda máquina importante tem que ter um grande botão vermelho. Mas realmente, é muito robusta. Você pode realmente estar fazendo chips de DNA na sua garagem, e decodificando alguns programas genéticos bem rapidamente. É muito divertido. (Risos)

E então o que a gente fez -- e esse é um projeto muito legal -- nós apenas começamos fazendo um chip de um vírus respiratório. Eu falei sobre isso -- você sabe, aquela a situação quando você vai na clínica e você não recebe um diagnóstico? Bem, nós apenas colocamos basicamente todos os vírus respiratórios humanos em um chip, e nós jogamos uns vírus de herpes para melhorar um pouco -- Quero dizer, por que não? A primeira coisa que você faz como um cientista é, você tem que ter certeza que a coisa funciona. Então o que nós fizemos foi apenas pegar células de cultura de tecidos e infectá-las com vários vírus, e nós pegamos isso e marcamos fluorescentemente o ácido nucleico, o material genético que sai dessas células de culturas de tecidos -- principalmente coisas virais -- e colamos no conjunto para ver onde ia colar. Agora, se a sequencia de DNA combinar, eles irão colar juntos, e então nós podemos olhar as manchas. E se as manchas brilharem, nós sabemos que tem um certo vírus lá.

Isso é com o que um desses chips realmente se parece, e essas manchas vermelhas são na verdade sinais vindos dos vírus. E cada mancha representa uma família de vírus diferente ou espécies de vírus E então, esta é uma maneira dura de se ver as coisas, então eu vou apenas codificar coisas como um pequeno código de barras, agrupado por família, então você pode ver os resultados de uma maneira muito intuitiva. O que nós fizemos foi, nós pegamos células de cultura de tecidos e as infectamos com adenovírus, e você pode ver esse pequeno código de barras amarelo perto dos adenovírus. E, da mesma maneira, nós infectamos com parainfluenza-3 -- este é um paramyxovírus -- e você vê um pequeno código de barras aqui. E então nós fizemos o vírus respiratório syncytial. Isso é o que aflige as creches de todos os lugares -- é como a doença do bicho papão, basicamente. (Risos) Você pode ver -- você pode ver que esse código de barras é da mesma família, mas é diferente de parainfluenza-3, o que lhe causa uma gripe muito forte. E então nós estamos conseguindo assinaturas únicas, uma impressão digital para cada vírus. Polio e rhino: eles estão na mesma família, muito próximos um do outro. Rhino é a gripe comum, e todos vocês sabem o que polio é, e você pode ver que essas assinaturas são diferentes. E vírus da herpes associado com sarcoma de Kaposi mostra uma ótima assinatura aqui embaixo. E então não é uma faixa qualquer ou qualquer coisa assim que diz que eu tenho um vírus de um tipo específico aqui; é o código de barras que em conjunto representa a coisa toda.

Tá certo, eu posso ver um rhinovírus -- e aqui está ampliado pequeno código de barras do rhinovírus -- mas e esses rhinovirus diferentes? Como eu sei qual rhinovirus eu tenho? Existem 102 variações conhecidas da gripe comum, e existem apenas 102 porque as pessoas se cansaram de coletá-los: existem variações novas todos os anos. E então, aqui estão quatro rhinovirus diferentes, e você pode ver, mesmo com seus próprios olhos, sem qualquer programa de computador que combine os padrões com algorítimos de reconhecimento, que você pode distinguir cada um desses códigos de barras um dos outros.

Agora, isso é tipo um golpe baixo, porque eu sei qual é a sequência genética de todos esses rhinovirus, e na verdade eu desenvolvi o chip expressamente para ser capaz de separá-los, mas e os rhinovirus que nunca viram um sequenciador genético? Nós não sabemos qual é a sequência; nós apenas a pegamos do ambiente. Então, aqui estão quatro rhinovirus dos quais nós nunca soubemos nada -- ninguém nunca os sequenciou -- e você também pode ver que você tem padrões únicos e distinguíveis. Você pode imaginar a construção de uma biblioteca, seja ela real ou virtual, de impressões digitais de essencialmente todos os vírus. Mas isto é, de novo, um golpe baixo, né? Você tem células de culturas de tecidos: tem um montão de vírus. E as pessoas reais? Você não pode controlar pessoais reais, como você provavelmente sabe. Você não tem idéia do que alguém vai tossir em um copo, e isso é provavelmente complexo, certo? Poderia ter montes de bacterias, poderia ter mais de um vírus, e certamente tem material genético do hospedeiro, então como nós lidamos com isso? E como nós fazemos o controle positivo aqui?

Bom, é bem simples. Esse sou eu, recebendo uma lavagem nasal. E a idéia é, vamos inocular pessoas experimentalmente com vírus então nós -- isso é tudo aprovado pelo IRB, na verdade; eles foram pagos. E basicamente nós experimentalmente inoculamos pessoas com o vírus da gripe comum. Ou, ainda melhor, vamos apenas pegar pessoas direto do pronto socorro -- infecções do trato respiratório indefinidas, adquiridas na comunidade. Você não tem idéia do que entra pela porta. Então, vamos começar com o controle positivo primeiro, onde nós sabemos que a pessoa era saudável. Eles receberam uma dose de vírus pelo nariz, vamos ver o que acontece.

Dia zero: Nada acontece. Eles estão saudáveis; eles estão limpos -- é impressionante. Na verdade, nós pensávamos que o trato nasal estaria cheio de vírus mesmo quando você está andando por aí todo saudável. É muito claro. Se você está saudável, você está muito saudável. Dia dois: nós pegamos um padrão muito robusto de rhinovirus, e é muito semelhante ao que a gente consegue no laboratório com o nosso experimento de cultura de tecidos. Então isso é ótimo, mas ainda assim, tiro no escuro, certo? Nós colocamos um montão de vírus no nariz desse cara. Nós -- (Risos) -- Quero dizer, nós queremos que funcione. Quer dizer, ele realmente tinha uma gripe. Então, o que acontece com as pessoas que estão andando nas ruas?

Então aqui estão dois indivíduos representados pelos seus códigos de identidade anônimos. Ambos têm rhinovirus; nós nunca vimos esse padrão no laboratório. Nós sequenciamos parte dos vírus deles; eles são novos rhinovirus que ninguém nunca viu. Lembre-se, nossas sequências conservadas com a evolução as quais estamos usando nesse conjunto para detectar menos vírus novos ou não caracterizados, porque nós escolhemos o que está conservado através da evolução. Aqui está outro cara. Você pode brincar do jogo do diagnóstico você mesmo. Esses blocos diferentes representam os diferentes vírus na família dos paramyxovirus, então você pode continuar procurando e ver onde o sinal está, você sabe. Bem, não tem o vírus CDV canino, o que é provavelmente bom. (Risos) Mas até você conseguir bloquear nove, você vai ver aquele vírus respiratório syncytial. Talvez eles tenham filhos. E aí você pode ver, também, o membro da família que está relacionado: o RSVB está aparecendo aqui. Então, isso é ótimo. Aqui está outro indivíduo, amostrado em dois dias diferentes -- visitas repetidas à clínica. Este indívíduo tem parainfluenza-1, e você pode ver que existe uma pequena faixa aqui para o vírus Sendai: isso é parainfluenza de ratos. As relações genéticas são muito próximas aqui. Isso é muito divertido.

Então, nós construímos o chip. Nós fizemos um chip que tem todos os tipos de vírus já conhecidos e descobertos. Por que não? Cada vírus de planta, cada vírus de inseto, cada vírus marinho. Tudo que nós podemos pegar do GenBank -- isto é, o repositório nacional de sequências. Agora nós estamos usando esse chip. E para que nós estamos usando ele? Bem, primeiro de tudo, quando você tem um chip grande como esse, você precisa de um pouco mais de informática, então nós desenvolvemos o sistema para fazer diagnósticos automáticos. E a idéia é, nós simplesmente temos padrões virtuais -- porque nós nunca vamos ter amostras de todos os vírus; e isto seria praticamente impossível. Mas nós podemos ter padrões virtuais, e compará-los com nossos resultados observados, o que é uma mistura muito complexa, e vem com um tipo de escore da probabilidade de que seja um rhinovirus ou algo assim. E isso é com que isso se parece. Se, por exemplo, você usar uma cultura de células que está cronicamente infectada com papiloma, você tem uma pequena leitura de computador aqui, e nosso algoritmo diz que é provavelmente papiloma tipo 18. E isto é, de fato, com o que essas culturas de células em particular estão cronicamente infectadas.

Então vamos fazer algo um pouco mais complicado. Nós colocamos um bip na clínica. Quando alguém aparece, e o hospital não sabe o que fazer por que eles não conseguem diagnosticar, eles ligam para nós. Essa é a idéia, e nós estamos estabelecendo isso perto de San Fransisco. E então, esse relato de caso aconteceu três semanas atrás. Nós temos uma mulher saudável de 28 anos, sem histórico de viagem, (inaudível), não fuma, não bebe. 10 dias de histórico de febre, suores noturnos, catarro com sangue -- ela está tossindo sangue -- dor muscular. Ela foi para a clínica, e eles lhe deram antibióticos, certo, e depois a mandaram para casa. Ela voltou depois de dez dias de febre, certo -- ainda tem febre -- e ela está hipoxica -- ela não tem muito oxigênio nos seus pulmões. Eles fizeram uma tomografia. Um pulmão normal estaria meio escuro e preto aqui. Toda essa parte branca -- não é bom. Essa formação parecida com uma árvore e brotos indica que tem uma inflamação; provavelmente tem uma infecção. OK. Então, o paciente foi tratado na época com um antibiótico de terceira geração cefalosporina, e doxiciclina, e no terceiro dia, não ajudou: ela continuou até falência aguda. Eles tiveram que entubá-la, então eles colocaram um tubo na garganta dela e eles começaram a ventilá-la mecanicamente. Ela não podia mais respirar sozinha. O que fazer depois? Não sei. Mudar os antibióticos, então eles trocaram para outro antibiótico, e Tamiflu, que -- não está claro porque eles acharam que ela tinha a gripe -- mas eles trocaram para Tamiflu.

E no sexto dia, eles basicamente pediram arrego. Você faz uma biópsia de pulmão aberto quando você não tem nenhuma outra opção. Existe uma taxa de mortalidade de oito por cento apenas por realizar esse procedimento, e então basicamente -- e o que eles aprenderam com isso? Você está olhando para a biopsia de pulmão aberto dela. E eu não sou patologista, mas você pode dizer muito a partir disso. Tudo o que você pode dizer é, existe muito inchaço: bronquiolite. Não era revelador: esse foi o relatório do patologista. E então, para o que ela foi testada? Eles têm seus próprios testes, claro, e então eles a testaram para mais de 70 diferentes combinações, para cada tipo de bactéria e fungos e combinações de vírus que você pode comprar na pronta entrega. SARS, metapneumovirus, HIV, RSV -- todos esses. Todos foram negativos. Mais de 100.000 dólares gastos com exames. Quero dizer, eles fizeram o máximo por essa mulher.

E basicamente no oitavo dia de hospitalização, eles nos chamaram. Eles nos deram uma aspiração endotraqueal -- você sabe, um pouco de fluido da garganta, deste tubo que eles colocaram lá -- e eles nos deram isto. Nós colocamos no chip; o que nós vimos? Bem, nós vimos parainfluenza-4. Bem, que diabos é parainfluenza-4? Ninguém testa para parainfluenza-4. Ninguém liga para isso. Na verdade, não é nem muito sequenciada. Existe apenas um pedacinho dela que é sequenciado. Quase não existe nenhum estudo epidemiológico para ela. Ninguém nunca consideraria, porque ninguém tinha idéia que poderia causar falência respiratória. E por que isso? Apenas senso comum. Não existem dados -- nenhum dado para determinar se causa uma doença severa ou leve. Claramente, nós temos um caso de uma pessoa saudável que está piorando.

OK, este é um relato de caso. Eu vou dizer a vocês uma última coisa nestes últimos dois minutos isto não é publicado -- irá sair amanhã -- e é um caso interessante de como você pode usar esse chip para encontrar algo novo e abrir uma nova porta. Câncer de próstata. Eu não preciso mostrar muita estatística para vocês sobre câncer de próstata. A maioria de vocês já conhece: a terceira principal causa de fatalidades nos EUA. Vários fatores de risco, mas aqui está uma predisposição genética para o câncer de próstata. Para talvez cerca de 10 por cento dos câncers de próstata, existem pessoas que são predispostas a ele. E o primeiro gene que foi mapeado nos estudos de associação para isso, câncer de próstata que ocorre prematuramente, foi esse gene chamado RNASEL. O que é isso? É uma enzima de defesa antiviral. Então, nós estamos sentados pensando, Por que os homens que têm essa mutação, um defeito no sistema de defesa antiviral, têm câncer de próstata? Não faz sentido -- a não ser que, talvez, exista um vírus.

Então, nós colocamos tumores -- e agora nós temos mais de 100 tumores -- na nossa coleção. E nós sabemos quem tem defeitos em RNASEL e quem não tem. E eu estou mostrando para vocês o sinal do chip aqui, e eu estou mostrando para vocês o bloco dos oligos de retrovírus. E o que eu estou dizendo para vocês aqui a partir deste sinal é, que homens que têm uma mutilação nesta enzima de defesa antiviral, e quem tem um tumor, geralmente tem -- 40 por cento das vezes -- uma assinatura que revela um novo retrovirus. OK, isso é bem louco. O que é isso? Então, nós clonamos o vírus inteiro. Primeiro de tudo, eu vou dizer a vocês o que uma pequena predição automática nos disse que era muito semelhante à um vírus de rato. Mas isso não nos diz muita coisa, então nós clonamos a coisa toda. E o genoma viral que eu estou mostrando para vocês aqui? É um clássico gamma retrovirus, mas é totalmente novo; ninguém tinha visto isso antes. Seu parente mais próximo é, na verdade, de ratos, e então nós chamariamos isso de um retrovirus xenotropico, porque está infectando uma espécie que não é ratos. E esta é uma pequena árvore filogenética para ver como ele é relacionado a outros vírus. E então o que nós fizemos para muitos pacientes agora, e nós podemos dizer que elas são todas infecções independentes. Eles todos têm o mesmo vírus, mas eles são diferentes o suficiente para que não haja nenhuma razão para acreditar que eles foram adquiridos independentemente. Está realmente no tecido? E eu vou finalizar com isso. Sim. Nós pegamos pedaços dessas biópsias do tecido do tumor e usamos materiais para localizar o vírus, e nós encontramos células aqui com partículas virais nelas. Esses caras realmente têm esses vírus.

Esse vírus causa o câncer de próstata? Nada do que eu estou dizendo aqui implica em casualidade. Eu não sei. É um link para a oncogênese? Eu não sei. É o caso acreditar que esses caras são mais susceptíveis aos vírus? Pode ser. E isso pode não ter nada a ver com o câncer. Mas agora é uma porta. Nós temos uma forte associação entre a presença deste vírus e uma mutação genética que está relacionada com o câncer. É aqui que nós estamos. Então, tenho medo que isso gere mais perguntas do que respostas, mas isso é para o que, você sabe, a ciência é muito boa. Isto tudo feito por pessoas no laboratório; Eu não posso ficar com os créditos pela a maioria disso. Isto é uma colaboração entre mim e Don. Este é o cara que começou esse projeto no meu laboratório, e este é o cara que vem fazendo as coisas de próstata. Muito obrigado.