Il ViroScan di Joe DeRisi svela alcuni misteri della medicina

Com'è, come possiamo studiare questa moltitudine di virus che ci circonda, e aiutare la medicina? Come possiamo trasformare le nostre conoscenze di virologia in un test diagnostico semplice e portatile? Voglio convertire tutto ciò che sappiamo al momento riguardo all'identificazione dei virus e alla gamma dei virus esistenti in, diciamo, un piccolo chip.

Quando abbiamo iniziato a riflettere su questo progetto -- su come avremmo creato un unico test diagnostico per analizzare contemporaneamente tutti gli agenti patogeni -- beh, c'è qualche problema da affrontare. Prima di tutto, i virus sono piuttosto complessi, ma si stanno anche evolvendo molto velocemente. Questo è un picornavirus. I picornavirus -- sono virus che comprendono il comune raffreddore e la polio, cose di questo genere. State vedendo il rivestimento esterno del virus, e questo giallo qui indica quelle parti del virus che si stanno evolvendo molto, molto velocemente, mentre quelle blu non si stanno evolvendo molto velocemente. Quando la gente pensa alla produzione di reagenti per l'identificazione globale dei virus di solito l'evoluzione rapida rappresenta un problema, perché come si può identificare qualcosa che è in continuo cambiamento? Ma esiste un equilibrio nell'evoluzione: se da un lato si assiste a rapidi cambiamenti, dall'altro all'ultraconservazione -- cose che non cambiano quasi mai.

Così abbiamo approfondito un po' di più, e ora vi mostrerò i dati ottenuti. Questa è una cosa che può essere fatta semplicemente dal desktop di un computer. Ho preso un po' di questi piccoli picornavirus, come il comune raffreddore, la polio e così via, e li ho spezzati in piccoli segmenti, quindi ho preso questo primo tipo, chiamato coxsackievirus, e l'ho diviso in piccole finestre. Queste finestre saranno colorate in blu se un altro virus presenterà nel suo genoma una sequenza identica a quella di questo virus. Le sequenze che vediamo qui sopra-- che fra l'altro non cofidicano neanche per le proteine -- sono quasi del tutto identiche per tutti, e dunque potrei usare questa sequenza come marker per identificare una vasta gamma di virus, senza che sia necessario farlo uno per uno. Ora, questa è la parte dove c'è una grande diversità: qui è dove le cose si evolvono rapidamente. Qui in basso vedete che l'evoluzione è più lenta: meno diversità.

Ora, quando arriviamo qui al, diciamo, virus della paralisi acuta -- probabilmente una di quelle proprio brutte quando siete un'ape -- questo virus non ha quasi nulla in comune con il coxsackievirus, ma posso garantirvi che le sequenze più conservate tra i virus che vedete nella parte destra dello schermo si trovano in aree identiche proprio qui sopra. Quindi possiamo isolare queste aree di ultraconservazione attraverso l'evoluzione -- così come si sono evoluti questi virus -- scegliendo frammenti di DNA ed RNA in queste aree, affinché fungano nel nostro chip da reagenti di rilevamento.

Ok, quindi questo è quello che abbiamo fatto, ma come si farà a realizzarlo? Bene, da lungo tempo, da quando frequentavo il dottorato di ricerca, mi do da fare con i chip a DNA -- vale a dire, imprimendo DNA su vetro. Che è quello che vedete qui: questi puntini bianchi non sono altro che DNA fissato su vetro, quindi posso metterne migliaia sul nostro chip di vetro e usarli come reagenti di rilevamento. Abbiamo portato il nostro chip alla Hewlett-Packard e abbiamo usato il loro microscopio a forza atomica su uno di questi puntini, ed ecco ciò che si vede: qui si vedono proprio i filamenti di DNA distesi sul vetro. Quindi, quello che stiamo facendo è imprimere DNA su vetro -- minuscoli frammenti distesi -- e questi faranno da marker per agenti patogeni. OK, io per fare questi chip costruisco piccoli robot, sono proprio bravo a seminare tecnologia ovunque. Se avete abbastanza soldi per comprarvi una Camry, potete pure costruire uno di questi e infatti abbiamo pubblicato sul Web un manuale completo, interamente gratuito: fondamentalmente ordinando pezzi fatti in serie potete costruirvi una macchina da microarray in garage. Questa è la parte sul vitale interruttore di sicurezza per lo spegnimento. (Risate) Ogni macchina seria deve avere un grande bottone rosso. Ma davvero, è piuttosto resistente. Potreste davvero produrre chip a DNA in garage, e decodificare alcuni programmi genetici piuttosto rapidamente. Molto divertente. (Risate)

Quindi quello che abbiamo fatto -- è davvero un grande progetto -- abbiamo iniziato creando un chip per i virus respiratori. Ne ho già parlato -- avete presente, quei casi in cui andate in clinica e non vi danno nessuna diagnosi? Bene, fondamentalmente abbiamo messo tutti i virus respiratori dell'uomo su un chip, e per di più ci abbiamo buttato dentro anche il virus dell'herpes -- insomma, perché no? La prima cosa che fa uno scienziato è essere sicuri che le cose funzionino. Quindi abbiamo preso delle cellule coltivate in vitro e le abbiamo infettate con vari virus, le prendiamo e contrassegniamo l'acido nucleico con un fluorescente il materiale genetico che viene fuori da queste cellule coltivate in vitro -- principalmente roba virale -- e lo attacchiamo sull'array per vedere dove va ad appiccicarsi. Ora, se le sequenze di DNA corrispondono, si attaccheranno l'una all'altra, e quindi guardiamo i puntini. Se i puntini diventano fluorescenti, sappiamo che lì c'è un certo virus.

Questo è il vero aspetto di uno di questi chip, e questi puntini rossi sono effettivamente un segnale della presenza del virus. Ogni punto rappresenta una diversa famiglia di virus o una diversa specie di virus. Quindi, è un po' difficile esaminare le cose in questo modo, e così trasformerò le informazioni in un piccolo codice a barre, raggruppandole per famiglia, in modo che sia più semplice esaminare i risultati. Quello che abbiamo fatto è stato prendere delle cellule coltivate in vitro e infettarle con adenovirus, vedete questo piccolo codice a barre giallo accanto all'adenovirus. Allo stesso modo, le abbiamo infettate con parainfluenza 3 -- che è un paramixovirus -- e qui vedete un piccolo codice a barre. E dopo lo abbiamo fatto con il virus respiratorio sinciziale. È un flagello in tutti gli asili -- un'epidemia di muco, in sostanza. (Risate) Come potete vedere questo codice a barre è incluso nella stessa famiglia, ma è diverso dalla parainfluenza 3, che procura un fortissimo raffreddore. In questo modo otteniamo delle firme identificative, l'impronta digitale di ogni virus. Polio e rinovirus: appartengono alla stessa famiglia e sono molto vicini. Il rinovirus è quello del comune raffreddore, e la polio sapete tutti cos'è, e potete vedere che queste firme sono diverse. E l'herpes virus associato al sarcoma di Kaposi ci mostra la sua graziosa firma qui in basso. Quindi non è una striscia o altro a dirci che qui c'è quel particolare tipo di virus; è il codice a barre che rappresenta tutta la cosa.

Bene, vedo un rinovirus .. ed ecco qui ingrandito il piccolo codice a barre del rinovirus -- ma se ci fossero tipi diversi di rinovirus? Come farei a sapere qual è il mio? Esistono 102 varianti conosciute del comune raffreddore, e sono solo 102 perché poi si sono stufati di catalogarli: Ogni anno ne spuntano di nuove. Quindi, ecco quattro rinovirus diversi, e potete vederlo anche con i vostri occhi, senza alcun bisogno di un computer e di programmi complicati per il riconoscimento di pattern mediante algoritmi, che è possibile distinguere ciascuno di questi codici a barre dagli altri.

Ora, questo è proprio un colpo basso, perché conosco la sequenza genetica di tutti questi rinovirus, e il chip anzi l'ho progettato appositamente per poterli distinguere, ma che si fa con i rinovirus che non hanno mai visto un sequenziatore genetico? Non sappiamo quale sia la sequenza; li raccogliamo e basta. Quindi, ecco quattro rinovirus sui quali non abbiamo mai saputo nulla -- nessuno li ha mai sequenziati -- e anche qui potete vedere che si ottengono pattern unici e distinguibili. Immaginate di mettere su un archivio, vero o virtuale che sia, di impronte digitali di praticamente qualsiasi virus. Ma, di nuovo, questo è facile come sparare ai pesci in un barile, giusto? Abbiamo le cellule coltivate in vitro: ci sono migliaia di virus. Ma con la gente vera? La gente vera non si può controllare, come certo sapete già. Non si può sapere cosa finirà in una tazza con un colpo di tosse, e probabilmente è piuttosto complicato, no? Potrebbe contenere un sacco di batteri, potrebbe contenere più di un virus, e di certo contiene materiale genetico dell'ospite, quindi questo come lo risolviamo? E come lo eseguiamo qui il controllo positivo?

Beh, è abbastanza semplice. Questo sono io, durante un lavaggio nasale. L'idea è, facciamo un esperimento e inoculiamo i virus nelle persone così noi -- a proposito, tutto questo ha l'approvazione del Comitato Etico, eh; vengono pagati. Fondamentalmente nell'esperimento inoculiamo nelle persone il virus del comune raffreddore. Oppure, ancora meglio, prendiamo la gente appena fuori dal pronto soccorso -- infezioni non specificate delle vie respiratorie acquisite in comunità. Voi non avete idea di quello che passa da quella porta. Allora, prima di tutto iniziamo con il controllo positivo dove sappiamo che la persona era in buona salute. Hanno assunto una dose di virus per via nasale, vediamo che succede.

Primo giorno: non succede nulla. Stanno bene; intatti -- sorprendente. In realtà, ci aspettavamo che le cavità nasali potessero essere piene di virus anche quando si continui ad apparire in salute. Sono abbastanza pulite. Se stai bene, stai bene. Secondo giorno: otteniamo un massiccio pattern di rinovirus, molto simile a quello ottenuto in laboratorio nell'esperimento con tessuto coltivato. Ottimo, quindi. Ma, di nuovo, colpo basso, eh? Nel naso di questo tipo ci abbiamo infilato una marea di virus. Così -- (Risate) -- Insomma, volevamo che funzionasse. Insomma, gli è venuto davvero il raffreddore. Quindi, e la gente qualunque?

Ecco qui due persone rappresentate da codici identificativi anonimi. Entrambe hanno un rinovirus; non abbiamo mai trovato questo pattern in laboratorio. Abbiamo sequenziato parte dei loro virus; sono rinovirus nuovi che in effetti nessuno ha mai neanche visto. Ricordate, le sequenze conservate nell'evoluzione che usiamo su questo array ci consentono di individuare anche virus nuovi o atipici, perché selezioniamo quello che si è conservato durante l'evoluzione. Qui c'è un altro uomo. Potete giocare voi stessi a indovinare la diagnosi. Questi diversi blocchi rappresentano i diversi virus nella famiglia dei paramyxovirus, quindi potete scorrere i blocchi e vedere dove sia il segnale, sapete. Bene, non ha il cimurro; meglio così. (Risate) Ma quando arrivate al nono blocco, notate il virus respiratorio sinciziale. Forse hanno figli. Vedete anche il membro della famiglia connesso: qui compare il virus respiratorio sinciziale bovino. Dunque, ottimo. Qui c'è un altra persona, analizzata in due giorni diversi -- in diverse visite in clinica. Questa persona ha la parainfluenza 1, e vedete che qui c'è una piccola striscia per il virus Sendai: si tratta della parainfluenza che infetta i topi. I rapporti genetici sono molto stretti. Molto divertente.

Dunque, abbiamo costruito il chip. Abbiamo prodotto un chip che contiene tutti i virus scoperti fino a oggi. Perché no? Tutti i virus delle piante, tutti i virus degli insetti, tutti i virus marini. Tutto quello che abbiamo potuto tirare fuori da GenBank -- ovvero dall'archivio nazionale delle sequenze. Ora usiamo questo chip. E per cosa lo usiamo? Beh, prima di tutto, con un chip grande come questo occorre un po' più di informatica, quindi abbiamo progettato il sistema in modo che effettui la diagnosi automaticamente. E l'idea è quella di limitarsi ai soli modelli virtuali -- dato che non avremo mai i campioni di tutti virus; sarebbe praticamente impossibile. Ma possiamo ottenere modelli virtuali, e confrontarli con i risultati ottenuti, che è una combinazione complessa, e fornisce una specie di punteggio di quanto è probabile che si tratti di rinovirus o altro. Ecco come appare. Se, per esempio, sono state usate delle cellule coltivate infette da papilloma virus in forma cronica, si ottiene qui una piccola lettura computerizzata, e il nostro algoritmo ci dice che probabilmente si tratta di papilloma virus di tipo 18. E in effetti è proprio da questo che le cellule coltivate in questione sono infette in forma cronico.

Allora proviamo qualcosa di un po' più difficile. Abbiamo installato un cercapersone in clinica. Quando si presenta qualcuno e in ospedale non sanno cosa fare perché non riescono a formulare una diagnosi, ci chiamano. L'idea è questa, lo stiamo allestendo nella Bay Area. E allora, questo caso risale a tre settimane fa. Abbiamo una donna di 28 anni, precedentemente sana, nessun viaggio recente, [poco chiaro], non fuma, non beve alcolici. da dieci giorni presenta febbre, sudorazione notturna, sangue nell'espettorato -- tossisce sangue -- dolori muscolari. È andata in clinica e le hanno dato degli antibiotici, bene, e poi l'hanno mandata a casa. Ci è tornata dopo dieci giorni di febbre, bene -- la febbre ce l'ha ancora -- ed è in ipossia --non ha abbastanza ossigeno nei polmoni. Le hanno fatto una TAC. Un polmone normale qui sarebbe tutto scuro. Tutta questa roba bianca -- non è un buon segno. Questa specie di formazione ad albero indica un'infiammazione; è probabile che ci sia un'infezione. OK. Dunque la paziente è stata trattata con cefalosporine di terza generazione e doxiciclina, ma, dopo tre giorni, nessun miglioramento: si è aggravata fino all'insufficienza respiratoria acuta. Hanno dovuto intubarla, le hanno infilato un tubo in gola e hanno iniziato la ventilazione artificiale. Non era più capace di respirare da sola. Che fare dopo? Non si sa. Cambiare antibiotici, così sono passati a un antibiotico diverso, e al Tamiflu, che -- non è ben chiaro perché abbiano pensato che avesse l'influenza -- ma sono passati al Tamiflu.

E dopo sei giorni fondamentalmente hanno gettato la spugna. Quando non si sa che altro fare, si fa la biopsia polmonare a cielo aperto. Esiste un tasso di mortalità dell'8% quando si effettua questa procedura, quindi fondamentalmente -- cosa ne ricavano? Vedete qui la sua biopsia polmonare a cielo aperto. Io non sono un patologo, però questa non ci dice molto. Si può rilevare solo che c'è un forte gonfiore: bronchiolite. Niente che aiuti a chiarire: questo il referto del patologo. E allora, a quali esami è stata sottoposta? Naturalmente hanno i loro esami e quindi l'hanno sottoposta a 70 tipi diversi di analisi, per qualunque tipo di batterio e fungo e campione virale in circolazione: SARS, metapneumovirus, HIV, VRS -- tutti questi. Tutto ha avuto esito negativo. Esami che costano più di 100.000 dollari. Voglio dire, hanno fatto del loro meglio per questa donna.

E in sostanza all'ottavo giorno di ricovero, ecco che ci hanno chiamato. Ci hanno consegnato l'aspirato endotracheale -- avete presente, un po' di liquido prelevato dalla trachea, attraverso un tubo inserito dentro -- e ce lo hanno consegnato. Lo abbiamo messo sul chip; che cosa troviamo? Beh, abbiamo trovato la parainfluenza 4. Bene, che diavolo è questa parainfluenza 4? Nessuno effettua l'esame per la pararainfluenza 4. Nessuno se ne interessa. In realtà il virus non è neanche sequenziato così tanto. Ne è stato sequenziato appena un pezzo. Non è stato oggetto di quasi nessuno studio epidemiologico. Nessuno lo avrebbe proprio considerato, perché nessuno aveva la più pallida idea che potesse essere causa di insufficienza respiratoria. E perché? Solo voci. Non ci sono dati -- nessun dato che dimostri se causi malattie lievi o gravi. È chiaro che ci troviamo davanti al caso di una persona che stava bene ma ora è in pericolo.

OK, questo è un caso clinico. negli ultimi due minuti vi dirò un'ultima cosa che non è stata ancora pubblicata -- uscirà domani -- ed è un caso interessante su come si potrebbe usare questo chip per scoprire qualcosa di nuovo e aprire nuove porte. Cancro della prostata. Non c'è bisogno che io vi fornisca molte statistiche sul cancro dela prostata. La maggior parte di voi lo saprà già: terza causa di morte per cancro negli Stati Uniti. Molti i fattori di rischio, ma esiste una predisposizione genetica al cancro della prostata. Più o meno nel 10% dei casi di cancro della prostata, si tratta di persone con predisposizione. E il primo gene mappato negli studi di associazione per questo, il cancro della prostata a insorgenza precoce, è stato questo gene chiamato RNASEL. Cos'è? È un enzima di difesa antivirale. Così ci siamo fermati un po' a pensare, perché gli uomini che presentano la mutazione, un difetto del sistema di difesa antivirale, si ammalano di cancro alla prostata? Non ha senso -- a meno che, forse, ci sia un virus.

Così abbiamo messo i tumori -- ne abbiamo raccolti più di 100 finora -- sul nostro array. E sappiamo chi ha un difetto del RNASEL e chi no. Qui vedete il segnale del chip, e qui vedete il blocco di oligo del retrivirus. Quello che posso dirvi guardando il segnale è che gli uomini che presentano una mutazione in questo enzina di difesa antivirale, e che hanno un tumore, spesso hanno -- nel 40% dei casi -- una forma caratteristica che rivela un nuovo retrivirus. OK, piuttosto bizzarro. Cos'è? Allora, cloniamo l'intero virus. Prima di tutto, vi dico che la previsione computerizzata ci ha detto che era molto simile a un virus che colpisce i topi. Ma questo non ci dice molto, così in realtà cloniamo tutto. E il genoma vorale che vedete qui? è un tipico gammaretrovirus, ma completamente nuovo; nessuno lo ha mai visto prima. ll suo simile più prossimo infatti proviene dai topi, e per questo è stato chiamato retrovirus xenotropico, perché sta infettando una specie diversa dal topo. Questo è un piccolo albero filogenetico che ci mostra i rapporti di parentela con gli altri virus. Lo abbiamo fatto per molti pazienti fino a oggi, e possiamo dire che sono state tutte infezioni a sé stanti. Sono accomunate tutte dallo stesso virus, ma sono abbastanza diverse da farci ritenere che siano state contratte in modo indipendente. Si trova davvero nei tessuti? E con questo concludo. Sì. Prendiamo frammenti di queste biopsie di tessuti tumorali, usiamo del materiale per individuale il virus e troviamo le cellule che contengono particelle virali. Questa gente ce lo ha davvero, il virus.

Il cancro alla prostata è causato davvero da questo virus? Niente di ciò che ho detto implica che questa sia la causa. Non lo so. Esiste una connessione con l'oncogenesi? Non lo so. Si tratta solo di un caso di gente particolarmente predisposta ai virus? Può darsi. E potrebbe non avere niente a che fare con il cancro. Ma ora c'è una nuova possibilità da esplorare. Abbiamo rilevato una forte corrispondenza fra la presenza di questo virus e una mutazione genetica collegata al cancro. Intanto siamo arrivati a questo. Quindi, fa sorgere più domande che risposte, temo, ma, lo sapete, la scienza è fatta un po' per questo. Tutto questo viene fatto dalla gente in laboratorio; Non posso prendermi io tutto il merito. Questa è una collaborazione fra me e Don. Lui è quello che ha dato inizio al progetto nel mio laboratorio, e lui quello che si sta occupando della faccenda della prostata. Molte grazie.